Recherche de l'équipe RBS


L'équipe "RBS" (Ribosomes, Bactéries et Stress) est dédiée à l'étude des interactions macromoléculaires impliquées dans la traduction des protéines chez les bactéries. Notre programme de recherche est divisé en trois voies d'investigation dont les trajectoires se croisent constamment :

1 - Nous menons des études moléculaires et fonctionnelles du ribosome, en nous concentrant sur la trans-traduction. Ce mécanisme assure le recyclage des ribosomes bloqués et la dégradation des protéines naissantes incomplètes lorsque des ARN messagers (ARNm) incomplets sont traduits dans plusieurs conditions de stress. Il est frappant de constater que la trans-traduction est essentielle à la survie de nombreuses bactéries pathogènes.

Trans-translation_mecanism

Le mécanisme de trans-traduction. (1) Après aminoacylation de l'ARNt par l'alanyl-ARNt synthétase (AlaRS), le complexe quaternaire Ala-tmRNA-SmpB-EF-Tu-GTP est formé. (2) Étape de pré-accommodation : le complexe quaternaire reconnaît le site A vacant grâce à la queue C-terminale de SmpB. (3) Étape d'accommodation : EF-Tu est libéré après l'hydrolyse du GTP en GDP. Ala-tmRNA-SmpB se loge dans le site A et le transfert peptidique a lieu sur le TLD de l’ARNtm. (4) Étape de translocation : après le transfert peptidique du peptide naissant de l'ARNt du site P vers l'ARNt Ala, EF-G-GTP se lie au ribosome. Le TLD-SmpB et l'ARNt sont transloqués vers les sites P et E, respectivement. Le codon de reprise de l'ARNt est alors parfaitement positionné dans le site A pour le décodage (5). Au cours de cette étape, l'ARNm non-stop défectueux est dégradé par la RNase R. (6) Elongation et terminaison : la traduction canonique reprend sur le MLD de l’ARNtm jusqu'à ce que le ribosome atteigne le codon de terminaison, au sein de l'hélice H5. Le peptide marqué est libéré, et les deux sous-unités ribosomiques sont dissociées pour être recyclées. Le peptide marqué est alors reconnu par les protéases et dégradé. (Guyomar & Gillet. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2019).

 

2 - Nous étudions les structures haute résolution de ribosomes par cryo-microscopie électronique (cryo-EM). Cet axe de recherche nécessite une approche multidisciplinaire et intégrée de la biologie structurale. En effet, à partir des données biologiques obtenues dans la partie 1, nous analysons plusieurs étapes de la trans-traduction qui restent insaisissables, ainsi que la façon dont les facteurs de protection du ribosome interagissent avec le ribosome. La cryo-EM est une méthode de choix pour étudier les structures 3D de grands complexes macromoléculaires. Les données sont récoltées sur des microscopes FEI Titan Krios équipés de détecteurs d'électrons directs, grâce à des plateformes accessibles via des infrastructures françaises et européennes de biologie structurale telles que FRISBI (http:/frisbi.eu) ou Instruct ERIC (https://instruct-eric.eu). Ce workflow a été appliqué avec succès par notre équipe, conduisant aux premières reconstructions 3D haute résolution de ribosomes bloqués.

 

Trans_translation_CryoEM

Structures de cryo-EM à haute résolution de cinq états consécutifs de trans-traduction. Les états de pré-accommodation, d'accommodation* et d'accommodation, de translocation et de translocation intermédiaire* nouvellement décrite sont représentés ici. La sous-unité 50S est en bleue, le 30S en kaki, l’EF-Tu en rose, l’ARNm en violet, SmpB en rouge, l'ARNt en vert et l'ARNm non-stop en jaune.

 

3 - Nous développons de nouveaux inhibiteurs de sauvetage du ribosome. Afin de détecter les inhibiteurs puissants de la trans-traduction dans les bactéries, nous avons créé des systèmes de rapporteurs de fluorescence fiables : l'un dans E. coli (Macé et al., 2018) (demande de brevet n° EP 16.200144 ; 2016), l'autre in vitro (Guyomar et al., NAR 2020 Feb, brevet n° EP/2018/063780). Le système in vitro est basé sur le réassemblage de la GFP pour évaluer la trans-traduction (Schéma 1). Il a été développé en utilisant le modèle E. coli mais il a également été adapté aux bactéries pathogènes ESKAPE (Enterococcus faecium ; Staphylococcus aureus ; Klebsiella pneumonia ; Acinetobacter baumannii ; Pseudomonas aeruginosa et Enterobacter spp.) en raison de leur résistance accrue aux antibiotiques couramment utilisés (Thepaut et al., bioRxiv 2020.12.16.423090).

 

InVitro_Trans_translation

Schéma 1. Réassemblage de la GFP par trans-traduction in vitro. 1 : Traduction canonique de l'ARNm sfGFP1-10 sans codon stop (croix rouge). 2 : En raison de l'absence de signal de terminaison, le ribosome est bloqué. Deux ARNt sont dans les sites P (jaune) et E (violet), et le site A est vide. 3 : Le complexe tmRNAGFP11-SmpB se lie au ribosome bloqué, et la queue C-terminale de SmpB reconnaît le site A vide. 4 : La traduction redémarre grâce au MLD tmRNAGFP11, qui code le onzième domaine manquant de la sfGFP (section verte du tmRNA) et ajoute donc ce domaine à la sfGFP1-10 incomplète. 5 : Le processus se termine lorsque le codon stop de l'ARNt (étoile rouge) est atteint. La sfGFP complète est libérée et devient fluorescente. Les sous-unités 50S et 30S sont dissociées pour être réutilisées, et le complexe tmRNAGFP11-SmpB est recyclé.

 

Les systèmes de criblage sont utilisés pour développer de nouveaux inhibiteurs de la trans-traduction à partir d'une approche de conception de médicaments assistée par ordinateur basée sur la structure, et du criblage de bibliothèques de produits chimiques et naturels.

 

« Expertises et Techniques »

Nous suivons un cheminement constant depuis l'identification et l'amélioration de nouvelles molécules antibiotiques jusqu'à leur activité in vivo dans les bactéries ESKAPE. Les inhibiteurs de trans-traduction issus du criblage à haut débit seront chimiquement modifiés et améliorés. Enfin, nous espérons analyser structurellement leurs interactions avec le ribosome et les complexes ARNt-SmpB à l'aide de la cryo-EM.

- Nous mettons au point des tests biochimiques tels que des tests de trans-traduction in vitro pour permettre un criblage rapide et à haut débit de l'activité des molécules sur les systèmes de sauvetage des ribosomes de pathogènes ESKAPE.

- De nombreux essais microbiologiques sont mis en œuvre : les candidats les plus prometteurs sont évalués phénotypiquement par la détermination de la CMI (Concentration Minimale Inhibitrice) sur un ensemble de souches résistantes et cliniques prédéfinies. Nous analysons également, pour des médicaments spécifiques, si les mécanismes de résistance ont évolué dans divers ESKAPE ainsi que la résistance croisée potentielle avec des antibiotiques classiques ciblant le ribosome.

- Nous procédons à des analyses structurelles par cryo-microscopie électronique : La cryo-EM est utilisée pour déterminer les structures des inhibiteurs liés aux ribosomes bloqués et/ou aux complexes ARNtm-SmpB. Cette technique est devenue une méthode de choix pour étudier la structure 3D de grands complexes macromoléculaires. Le développement sans cesse croissant des microscopes à haute résolution, des détecteurs directs d’électrons et des logiciels de traitement d'images, a conduit à une "révolution de la résolution" dans ce domaine. Cela ouvre la voie à l'analyse structurelle, à une résolution (quasi) atomique, de complexes macromoléculaires actifs qui seraient inaccessibles à la cristallographie aux rayons X ou à la RMN. Un autre avantage majeur est la possibilité de visualiser les macromolécules à l'état totalement hydraté, ce qui permet d'observer les changements de conformation directement liés à leurs activités biologiques.