Soutenance de thèse - Elif Begüm Gökerküçük

Soutenance de thèse de Elif Begüm Gökerküçük

Development and characterization of microscopy-based approaches to monitor autophagy and mitochondrial functions in living cells

Bien que plusieurs mécanismes d'autophagie aient été disséqués au cours de la dernière décennie, le suivi de cette voie en temps réel reste difficile. Parmi les premiers événements conduisant à l'activation de l'autophagie, la protéase ATG4B amorce l'acteur clé de l'autophagie, LC3B. Étant donné le manque de rapporteurs pour suivre cet événement dans les cellules vivantes, nous avons développé un biocapteur FRET (Förster's Resonans Energy Transfer) répondant à l'amorçage de LC3B par ATG4B. Le biocapteur a été généré en flanquant LC3B dans une paire FRET donneur-accepteur résistant au pH, Aquamarine/tdLanYFP. Mon travail de thèse principal a été consacré à la caractérisation de ce biocapteur en utilisant un microscope développé dans notre équipe appelé fastFLIM (fast Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy). Nous avons montré que le biocapteur a une double lecture. Premièrement, le FRET indique l'amorçage de LC3B par ATG4B et la résolution de l'image FRET permet de caractériser l'hétérogénéité spatiale de l'activité d'amorçage. Deuxièmement, la quantification du nombre de puncta Aquamarine-LC3B détermine le degré d'activation de l'autophagie. Nous avons ensuite montré qu'il existe de petits pools de LC3B non amorcés lors de la régulation négative d'ATG4B, et que l'amorçage du biocapteur est complètement aboli dans les cellules knock-out ATG4B. Enfin, nous avons recherché des inhibiteurs d'ATG4B disponibles dans le commerce, et nous avons illustré leur mode d'action différentiel en mettant en œuvre un pipeline d'analyse à résolution spatiale, large à sensible, combinant le FRET et la quantification des ponctuations autophagiques. Par conséquent, le biocapteur FRET LC3B ouvre la voie à un suivi hautement quantitatif de l'activité ATG4B dans des cellules vivantes et en temps réel, avec une résolution spatio-temporelle sans précédent. Dans la deuxième partie de ma thèse, j'ai étudié les altérations de la dynamique mitochondriale et des niveaux de protéines OXPHOS mitochondriales dans des cellules cancéreuses de mélanome sensibles et résistantes à la chimiothérapie en utilisant un test microscopique de photoconversion et des tests biochimiques. Les résultats préliminaires et les observations résultant de cette étude ont jeté les bases du projet plus vaste de notre équipe, qui consiste à utiliser des biocapteurs multiplex, dont le biocapteur LC3B, pour suivre l'autophagie/mitophagie et plusieurs fonctions mitochondriales simultanément dans des cellules vivantes.

  • Olivier DESTAING, reviewer, Institute for Advanced Biosciences, Grenoble
  • Robin KETTELER, reviewer, University College London, London
  • Anne CORLU, examiner, Institut NuMeCan, Rennes
  • Kristine SCHAUER, examiner, Institut Gustave Roussy, Villejuif
  • Giulia BERTOLIN, thesis supervisor, IGDR, Rennes
  • Marc TRAMIER, thesis supervisor, IGDR, Rennes